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角膜缘干细胞培养液影响血管内皮细胞增殖的实验研究
牛晓光 曾庆延 王 莉
本研究通过体外细胞培养的方法观察角膜缘干细胞培养上清液对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响。
1 材料与方法
1.1 实验所需试剂 人脐静脉血管内皮细胞（上海细胞生物中心提供），鼠抗人K3蛋白单克隆抗体（AE-5），荧光素标记的兔抗鼠二抗（美国Sigma公司）；MTT（噻唑蓝）（美国Sigma公刮）。
1.2 方法
1.2.1 角膜缘干细胞的培养和检测 角膜缘组织材料来自新鲜尸眼。采用组织块培养法于37℃、5%CO2，条件下进行常规培养。细胞完全形成单层后收集培养上清液，放人- 20℃冰箱备用。同样条件下培养近角膜缘处的球结膜上皮细胞作为对照，并收集上清液，- 20℃冰箱储存备用。通过间接免疫荧光法检测K3蛋白(AE-5)的表达间接检测角膜缘干细胞。
1.2.2 血管内皮细胞增殖的检测 调整人脐静脉血管内皮细胞数为lxl05个/ml，按每孔100µl细胞悬液加至96孔板。分为3组：A组加入100µl细胞悬液及100µl Hanks液；B组在加入100µl细胞悬液后，再加入同等体积的球结膜上皮细胞培养上清液；C组在加入100µl细胞悬液后加入同等体积的角膜缘干细胞培养上清液。3组均放人37℃、50%CO2：培养箱培养。各组血管内皮细胞培养24 h后弁去培养液，MTT法检测各组细胞的增殖活性。
1.3 统计学分析 3组问比较采用方差分析；组间曲曲比较采用q检验。所有数据均使用SPSS 10.0统计软件包进行分析。
2 结果
2.1 角膜缘干细胞的检测 免疫组织化学染色显示，结膜上皮细胞AE-5表达呈强阳性，细胞浆着染（图2）；而培养的角膜缘干细胞绝大多数呈阴性，只有散在的细胞呈现出弱阳性染色（图1）。
2.2 血管内皮细胞增殖活性的检测 加入角膜缘干细胞培养上清液的血管内皮细胞其MTT值略高于加入球结膜上皮细胞培养上清组和对照组，差异有显著性(P＜0.0l)；而加入球结膜上皮细胞培养上清组的血管内皮细胞增殖活性与对照组间无显著差异（表1）。
3 讨论
结构和功能是细胞和组织的两个重要方面，结构是功能的基础，功能又从一定程度上体现结构的特异性。因此从功能学方面进行研究从而推动角膜缘干细胞理论的发展不失为一条重要的途径。
角膜缘组织中存在有丰富的血管网，为角膜提供充足的营养，也保证了角膜缘干细胞保持旺盛的增殖活性所需要的营养。但是这些血管网如何维持？角膜缘干细胞在其中是否起一定的作用？通过本研究我们发现，角膜缘干细胞的培养上清可以促进血管内皮细胞的生长，推测这种作用可能是通过角膜缘干细胞分泌的一些促血管生长因子来实现的。刘文等在角膜缘组织中检测到有血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子和转化生长因子的表达，提示这些因了在维持角膜缘及角膜的正常生理功能方面起着重要的作用。根据我们的研究结果，我们推测正是由于角膜缘干细胞对血管内皮细胞增殖的这种促进作用，才使得角膜缘组织能够有充分的血供并提供足够的生长因子，从而能够维持角膜缘下细胞较强的生长和增殖能力。
