互联网医院
Avastin抑制兔角膜新生血管的实验研究
【摘要】 目的 探讨Avastin对角膜新生血管(NV)的抑制作用。方法 日本大耳白兔20只，以角膜缝线法制作角膜新生血管模型，观察4周。在角膜缝线1周后，实验组以浓度为4mg/mL的Ava-stin溶液滴眼，对照组以注射用水滴眼，均为每日2次，共28d。记录角膜新生血管出现的时间、生长的长度和数量。结果 两组角膜新生血管的出现时间分别为（3.43±0.53）d和(3. 14±0.69)d (P>0.05)；在缝线后14d、2ld、28d，实验组角膜新生血管的面积均明显小于对照组(P<0.05)。且实验组角膜新生血管在用药后明显变细。两组角膜荧光素染色在观察期间均未发现明显着色。结论Avastin滴眼能够有效抑制角膜新生血管的生长，并能在一定程度上使已有的新生血管消退，且未发现明显的毒副作用。
【关键词】Avastin；角膜血管新生；兔
Inhibition of corneal neovascularization by Avastin in rabbits. NIU Xiao-guang, ZENC Qing-yan, WU
Shang-cao. Wuhan Aier Ophthalmic Hospital, Wuhan , Hubei 430060, China
Correspanding outhor : NIU Xiao-guang , Email : niuxiaoguang@ yahoo. com
[Abstract] Objective To evaluate the effect of Aavastin to inhibit experimental corneal neovascu-larization. Methods Twenty rabbits were sutured on the superior cornea. Animals were randomly dividedinto 2 groups. After 7 days, 10eyes in the treatment group were given Aavastin drops(4 rog/mi) twice dai-ly, whereas 10 eyes in the control group received placebo ( normal saline drop8 twice daily) .The occurrenceand developement of CNV was observed on the 3 , 7 , 14 , 21 ,28 days after suturing by slit-lamp microscope,and the area of CNV was calculated. Fluorescein staining was detected for the integrity of corneal epitheli-um. Results The occurrence of CNV in group I was (3. 43±0. 53)d and group 2 (3.14±0.69)d. No significant difference in the occurrence time of CNV was found between group l and group 2. The CNV areasof group 1 were significantly smaller than that of group 2 at every time poin( P <0.05 ) . The diameter ofCNV was significantly smaller after Avastin treatment. Conclusion Avastin can inhibit and restrain cornealneovasculari2:ation at some degree without significant side effects.
[ Key words] Avastin; corneal neovascularization; rabbit
炙症及外伤等原因均可以引起角膜的血管新生( neovascualrization，NV)。角膜新生血管的出现不仅会降低角膜的透明度，而且在穿透性角膜移植中，由于新生血管破坏了角膜的免疫赦免状态，使术后免疫排斥反应的发生率明显增加【1】。此外，在角膜移植术后，角膜新生血管的发生、发展也严重影响了角膜植片的长期存活。因此如何有效的抑制角膜新生血管的形成已成为眼科工作者的重点研究课题。Avastin是一种针对血管内皮生长因子的血管新生抑制剂，在肿瘤的防治中已经取得了良好的效果。为了探讨Avastin在角膜NV中的应用价值，2008年7～9月以兔眼做实验，采用滴眼的方法，来观察Avastin对角膜NV的抑制作用。
1 资料和方法
1.1 角膜NV动物模型的制作【2】
采用缝线法制作角膜血管新生模型。健康成年日本大耳白兔20只，兔体质量1.5～2.0 kg，雌雄兼有。将兔用氯胺酮( 50mg/kg)、氯丙嗪(10mg/kg)肌肉注射诱导全身麻醉。0.40%倍诺喜表面麻醉。开睑器开睑。在手术显微镜下用5-0丝线从角膜上方向中央呈放射状缝2根线，缝线始端距角膜缘2.5 mm，跨距3 mm，深度达1/2～2/3角膜基质层，2根缝线之间的距离约为7 mm。
1.2 应用材料
Avastin为美国Genentech公司产品。为4 mL包裟，浓度25mg/mL。使用时以注射用水配置成浓度为4mg/mL的溶液。并置于4℃保存。
1.3 实验分组
随机将免分为A组及B组。
1.3.1 A组（实验组）：往缝线后1用于实验眼滴用Avatin溶液，每次1滴，每天2次，搀28 d。其10只。兔（10眼）。
1.3.2 B组（对照组）：在缝线衍1周于实验眼滴用注射用水，每次1滴，每天2次．共28d．共10只兔（10眼）。
1.4 角膜NV的动态定量分析
在缝线后第2天开始在裂隙灯显微镜下观察各组实验免。1周内每天舰察1次，待备只兔角膜新生血管都长出后改为每周观察1次。记录各组兔角膜新血管长出的时间、检测自角膜缘长出的新生血管的长度和数量，并照相记录。测量时，以连续弯曲度小、朝向角膜中央生长的最长血管为准、并按下列公式计算角膜新生血营分布的面积(mm2)：
A =(C/12)*3.1416*﹝r2-(r-L)2﹞（3）
A为角膜新生血管分布的面积，单忙为mm2
C为新生血管累及角膜的圆周钟点位数。
L为新生血管从角膜缘进入角膜的长度。
r为免角膜半径，约为7mm，
1.5 观察角膜上皮细胞
分别于缝线后14d、21d和28d通过角膜荧光素染色观察Avastin对角膜上皮细胞的影响。
1.6统计学方法
计量资料以上x±s表示，差异显著性采用t检验。数据统计运算采用SPSS 10.0 for Windows统计分折软件进行处理，以P＜0.05作为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 角膜新生血管出现的时间
在裂隙灯显微镜下观察，A组兔角膜新生皿管出现的时间为（3.43±0.53）d，B组为(3.14±0.69)d，两组间差异无统汁学意义(t=0.866，P=0.403)。#p#分页标题#e#
2.2 角膜NV的生长情况
2.2.1 A组：在角膜新生血管出现后，上方角膜开始伴有基质水肿，随着新生血管的生长角膜水肿逐渐加重。角膜新生血管在出现后生长速度明显加快．在14 d左右生长至缝线始端，21d时新生血管的生长达到了高蜂，最长血管已接近长至缝线末端。血管比较稀疏，管径明显较细。此后略有减退，角膜水肿也逐渐消退（图1）。
2.2.2 B组：上方角膜水肿明显严重于A组，14d后由于角膜水肿而使得缝线有所松动。角膜NV生长迅速，生长速度及长度同A组相似，分布密集，在整个上方角膜均可见到，以缝线处最为明显。在21d左右新生血管的生长达到了高峰，已长至甚至超过缝线末端。此后面积开始有所减退，角膜水肿也开始减轻。而角膜NV的长度仍略有所增加（图2）。
在角膜缝线后l4d、21d、28d，对各组角膜NV的面积及最长血管的长度分别进行t检验，发现在各时相A、B两组在角膜NV的面积方面存在着显著差异( P =0.0000)．A组明显小于B组（表1）
2.3 角膜情况
在各观察时相，两组角膜荧光素染包除缝线处外均未处明显着色。
3 讨论
日前所存在的新生血管形成的抑制剂如抑制基底膜降解的marimastat、抑制血管内皮细胞增生的TNP - 470以及作用于新生血管生长因子的药物如干扰索-a等都能在一定程度上抑制新生血管形成，但是绝大多数属于抗代谢药物，对机体的多种组织和细胞都有抑制作用，长期应用会导致明显的毒副作用(4)；而临床最为常用的糖皮质激素和非甾体类抗炎药物等并无特异性抑制血管新生的作用，其作用十分有限，而且存在着明显的副作用。
在正常角膜中，促血管形成因子和血管形成抑制因子的表达处于平衡状态。当这个平衡被打破，即可产生角膜的新生血管。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前公认的最有效的诱导新生血管形成的细胞因子。当角膜出现炎症或缺氧时，角膜局部VEGF的表达增加。VEGF对角膜血管新生的影响是多方面的。首先，VEGF有蛋白溶解活性，能够分解角膜缘小血管的血管膜，并且能够诱导血管内皮细胞增生，促进内皮细胞的移行，在新生血管管腔的形成过程中也能够起到一定的作用。在大鼠碱烧伤动物模型中，烧伤后24～48h眼局部VEGF的mRNA和蛋白的表达水平处于峰，是正常对照的75倍，而且在邻近烧伤区的表达比远离烧伤区的角膜缘部位要高的多。在新生血管消退期，VEGF的表达也明显减少，几乎接近于正常水平。由此可见VEGF与角膜新生血管关系的密切性。
Avastin（即bevacizumab）是由美国基因技术公司( Genentech)研制，并于2004年被FDA批准作为线直肠癌治疗药物的一种血管新生抑制剂（5）。Avastin生物制剂是一种新型的抗VEGF人源化单克隆抗体，他的分子结构主要是由人的IgC1框架区和鼠的单克隆抗体的抗原结合互补决定区组成，可以和VEGF的所有异构体发生高亲和力结合，间接阻断VECF和其受体的结合从而发挥抑制血管新生的作用。半衰期约为17～21 d。
国外有关Avastin抑制角膜血管新生的研究相对较多。Manzano[6]等通过应用4mg/mL的Avastin治疗碱烧伤后的大鼠角膜血管新生，结果发现治疗组角膜新生血管覆盖面积为38.2%，而对照组为63.5%；针对Stevens-Johnson综合症、角膜移植术后血管新生以及复发性翼状胬肉患者也进行了初步临床应用，结果不一。但国内尚未见相应报道。
我们采用了滴眼这种最传统、便捷的方式进行研究，并参照Manzano的使用浓度，对Avastin抑制缝线诱导的兔角膜血管新生的作用进行了观察。结果显示Avastin能够抑制角膜新生血管的生长，并能够使已经出现的新生血管部分消退，而且并没有对角膜上皮产生毒性，跟Pe rez-Santonja结果相一致(7)。
尽管我们的结果显示应用Avastin后角膜新生血管被明显抑制，但是这种抑制作用并不完全。我们推测可能跟以下原因有关：(1)用药浓度较低。我们所使用的浓度来自于Manzano的实验结果，这个结果相对较早。近来也有学者使用25mg/mL的Avastin溶液进行满眼或者结膜下注射。但如此高浓度的安全性还没有得到验证；(2)使用次数较少。每日2次的应用可能并不足够结合体内局部产生的VEGF。(3)在角膜新生血管的形成中还存在着其他细胞因子的作用，单一的抑制某一种因子并不能完全阻止新生血管的形成。
Avastin由于具有很小的副作用已经被批准应用于肿瘤患者。在眼部，707位玻璃体腔注射Avas-tin的患者中有9位(1.27%)出现并发症，包括角膜擦伤，结膜水肿，晶状体损伤，视网膜色素上皮撕裂，急性视力丧失等(8-9)。0.25～5.0 mg/mL的Avastin对培养的角膜纤维细胞，内皮细胞均无细胞毒性作用，而5mg/mL已是玻璃体注射的20倍剂量(9)。因此我们所使用的浓度是安全的，但需要进一步研究更高浓度Avastin的安全性。
总之，通过本研究可以看出，Avastin滴眼可以在一定程度上抑制角膜的血管新生，并能使已有的新生血管部分消退。但是在临床应用以前，Avastin的使用浓度以及药物的安全性还需要进行更进一步的研究。
在各观察时相，两组角膜荧光素染包除缝线处外均未处明显着色。
3 讨论
日前所存在的新生血管形成的抑制剂如抑制基底膜降解的marimastat、抑制血管内皮细胞增生的TNP - 470以及作用于新生血管生长因子的药物如干扰索-a等都能在一定程度上抑制新生血管形成，但是绝大多数属于抗代谢药物，对机体的多种组织和细胞都有抑制作用，长期应用会导致明显的毒副作用(4)；而临床最为常用的糖皮质激素和非甾体类抗炎药物等并无特异性抑制血管新生的作用，其作用十分有限，而且存在着明显的副作用。
在正常角膜中，促血管形成因子和血管形成抑制因子的表达处于平衡状态。当这个平衡被打破，即可产生角膜的新生血管。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前公认的最有效的诱导新生血管形成的细胞因子。当角膜出现炎症或缺氧时，角膜局部VEGF的表达增加。VEGF对角膜血管新生的影响是多方面的。首先，VEGF有蛋白溶解活性，能够分解角膜缘小血管的血管膜，并且能够诱导血管内皮细胞增生，促进内皮细胞的移行，在新生血管管腔的形成过程中也能够起到一定的作用。在大鼠碱烧伤动物模型中，烧伤后24～48h眼局部VEGF的mRNA和蛋白的表达水平处于峰，是正常对照的75倍，而且在邻近烧伤区的表达比远离烧伤区的角膜缘部位要高的多。在新生血管消退期，VEGF的表达也明显减少，几乎接近于正常水平。由此可见VEGF与角膜新生血管关系的密切性。
Avastin（即bevacizumab）是由美国基因技术公司( Genentech)研制，并于2004年被FDA批准作为线直肠癌治疗药物的一种血管新生抑制剂（5）。Avastin生物制剂是一种新型的抗VEGF人源化单克隆抗体，他的分子结构主要是由人的IgC1框架区和鼠的单克隆抗体的抗原结合互补决定区组成，可以和VEGF的所有异构体发生高亲和力结合，间接阻断VECF和其受体的结合从而发挥抑制血管新生的作用。半衰期约为17～21 d。
国外有关Avastin抑制角膜血管新生的研究相对较多。Manzano[6]等通过应用4mg/mL的Avastin治疗碱烧伤后的大鼠角膜血管新生，结果发现治疗组角膜新生血管覆盖面积为38.2%，而对照组为63.5%；针对Stevens-Johnson综合症、角膜移植术后血管新生以及复发性翼状胬肉患者也进行了初步临床应用，结果不一。但国内尚未见相应报道。
我们采用了滴眼这种最传统、便捷的方式进行研究，并参照Manzano的使用浓度，对Avastin抑制缝线诱导的兔角膜血管新生的作用进行了观察。结果显示Avastin能够抑制角膜新生血管的生长，并能够使已经出现的新生血管部分消退，而且并没有对角膜上皮产生毒性，跟Pe rez-Santonja结果相一致(7)。
尽管我们的结果显示应用Avastin后角膜新生血管被明显抑制，但是这种抑制作用并不完全。我们推测可能跟以下原因有关：(1)用药浓度较低。我们所使用的浓度来自于Manzano的实验结果，这个结果相对较早。近来也有学者使用25mg/mL的Avastin溶液进行满眼或者结膜下注射。但如此高浓度的安全性还没有得到验证；(2)使用次数较少。每日2次的应用可能并不足够结合体内局部产生的VEGF。(3)在角膜新生血管的形成中还存在着其他细胞因子的作用，单一的抑制某一种因子并不能完全阻止新生血管的形成。
Avastin由于具有很小的副作用已经被批准应用于肿瘤患者。在眼部，707位玻璃体腔注射Avas-tin的患者中有9位(1.27%)出现并发症，包括角膜擦伤，结膜水肿，晶状体损伤，视网膜色素上皮撕裂，急性视力丧失等(8-9)。0.25～5.0 mg/mL的Avastin对培养的角膜纤维细胞，内皮细胞均无细胞毒性作用，而5mg/mL已是玻璃体注射的20倍剂量(9)。因此我们所使用的浓度是安全的，但需要进一步研究更高浓度Avastin的安全性。
总之，通过本研究可以看出，Avastin滴眼可以在一定程度上抑制角膜的血管新生，并能使已有的新生血管部分消退。但是在临床应用以前，Avastin的使用浓度以及药物的安全性还需要进行更进一步的研究。
