中长期保存方法对角膜内皮细胞活性的影响

第26卷  第6期  航空航天医药
 
孙 喆，周明渡，李  玲
(哈尔滨爱尔眼科医院，黑龙江  哈尔滨  150076)

 
    摘要  目的：探索简易安全中长期保存供体角膜方法，评价保存后角膜内皮细胞活性为临床提供优质角膜材料。方法：建立简易中期保存液，深低温保存法保存大鼠角膜。将60只大鼠眼随即分为3组。分别为湿房保存，中期保存液和深低温保存。采用活性染色对角膜内皮细胞进行评价。判定3种方法保存的角膜内皮细胞的活性状态。结果：使用中期保存液和深低温保存后复温的角膜植片内皮细胞密度和活性率与湿房保存组比较差异无显著性。结论：简易中期保存液和深低温保存后角膜具有较好的内皮细胞活性和临床应用价值。
    关键词  保存方法；角膜内皮细胞
    中图分类号：R772.2    文献标识码：A    文章编号：1005 - 9334( 2010) 06-0841-02
 
An Experiment Study on the Effects of Intermediate and Long - term
     Cryopreservation Methods on Corneal Endothelium Viability
SUN Zhe, ZHOU Ming - bo, U Ling
( The Aier Ophthofmology, Hospital of Harbin., Harbin 150076, China)
      
Abstract  Objective :To invcstigate simple and safe methods of intermediate and long - term comeal preservation for clinical use and evaluate different preservation methods on comeal endothelium viability. Methods :Simple and easy intermediate and cryopreservation methods were established 60 rat eyeballs were randomly classified into 3 groups in the moist chamber storage, intermediate and long - term preservation.  The differencs of the viability of comeal endothelial cells after different preservation methods were compared Results: The vital staining showed that there were no significant among three preservation methods on the endothelial cell density ( cell/mm²) and ESR%. Conclusions: Intermediate and long-term cryopreserved methods is very useful on penetrating ketoplasty.
     Key words  Preservation methods; Endothelium; Viability
 
    角膜移植手术是治疗角膜病患者脱盲最有效的方法。眼库及角膜保存技术是开展角膜移植的基础和条件。但是目前角膜移植材料来源短缺及各地区材料分布不均匀，临床上不能满足角膜移植患者量多和应付急诊手术的要求，敌对有限移植材料的保存日益受到人们的重视。所以，建立有效的眼库和深入研究角膜保存方法，延长角膜的生命活力，充分利用有限的角膜材料，随时为临床角膜移植提供优质供体材料是一个重要课题。基于短期保存方法对角膜材料保存时间的限制，如果能做到中长期活性材料的保存，将为角膜移植的开展起到关键的作用。因此根据我国现有国情，从我眼库实际情况出发，积极建立简易中期保存和长期保存方法，通过观察比较不同保存方法对角膜内皮细胞活性染色来评价角膜内皮细胞的活性，得到了满意的优质活性角膜供体，为临床应用中长期保存材料行穿透性角膜移植奠定基础。
1  材料与方法
1.1  材料  Wister大鼠30只60眼，雌雄各半，体重150～200 g。I组为湿房保存组；Ⅱ组为中期保存液保存组；Ⅲ组为深低温保存组。
1.1.1  湿房保存组  摘取Wister大鼠眼20只后置4℃冰箱保存24 h。
1.1.2  中期保存组配置简易中期保存液，以细胞培养液MEM作为基础液，加入l%低分子右旋糖酐、2.5%硫酸软骨素；用碳酸氢钠调节pH值为7.2～7.4，过滤器过滤除菌；分装。用前加入庆大霉素使之浓度为100～200 ku/L(10µL)“℃冰箱保存^（1）。角膜植片的制备：处死后尽早取材，用庆大霉索生理盐水冲洗，在超净台上减取带1.0 mm巩膜环的角膜片，小心取出色素膜组织，注意整个过程勿伤及角膜内皮。将制备好的角膜植片（10片）内皮面向上置于分装好的中期保存液中保存5d。
1.1.3  长期保存组制备冷冻保存液：①号液：20%人血清白蚤白92%；DMS0 5.5%；硫酸软骨索2.5%；②号液：20%人血清白蛋白90%；DMS0 7.5%；硫酸软骨素2.5%。
1.2  方法  将配制好的抗冻剂装入高压灭荫的EP管中，将无菌条件下制备好的角膜植片（20片）内皮面向上置于预冷备用的1号液中，4℃冰箱平衡10 min；再将角膜片放入2号液中，4℃冰箱平衡1O min；将2号液从冰箱中移出，置于微机监控的程序化降温仪( Cryomed Freezer，USA)。所设程序为：设一个装有同样冷却剂的对照瓶，将膜膜标本温度探子插入保护剂中，以测定标本中的温度变化。降温时以角膜保护剂的温度为标准，先从4℃以1℃/min降至-1O℃，稳定2 min；再以2℃/min降至-30℃，稳定5 min；最后以5℃/min降至- 80℃，稳定4 min。此时将角膜容器连同角膜片直接浸泡于液氮中，并做好标记，贮存时间为11～12周。复温具本操作技术：将EP管从液氮中取出，待管内渗存的液氮自然喷蒸后，迅速放入50℃水浴箱中自轻轻飘动，待瓶内冷冻保存液融化，角膜片周围仅存留一层薄冰时，从水浴箱中取出，用无齿镊夹取角膜片外缘的巩膜环，立即移人4℃冰箱预冷的白蛋白中，10 min后可以供实验所用。将穿透性角膜移植剩下的角膜环用2.5 g/L台盼兰溶液滴于内皮面，4～5 min后将染料用生理盐水洗净；再将2 g/L茜素红溶液滴于内皮面，染色4～5 min，将染料洗净放人24.8 g/L的戊二醛中固定1O min（250 g/L戊二醛1O mL和0.2 mol/L磷酸缓冲液90 mL混合后，用NaOH调节pH至7.3，最后置于光学显微镜加目镜测微仪进行内皮细胞计数下检查并照相^{(2)#p#分页标题#e#}。每片角膜选5个视野，每个视野数1OO个细胞，判定内皮细胞存活率(ESR)，Special micro-scope检测内皮细胞密度、形态，用细胞分析系统CAS/EB2.0计算内皮细胞密度、内皮细胞均匀性及六角形细胞比例。通过内皮细胞的密度和存活率来判断角膜组织的保存效果，并对保存角膜植片进行筛选。
2  结果
    经不同方法保存后的角膜，各组大鼠角膜内皮细胞密度及活性率相似（表1）。中长期保存角膜只要关键步骤合理，角膜内皮细胞密度并不随保存时间延长而明显下降，这也正是此法的优越之处。我们观察到光镜下各角膜内皮细胞间连接紧密，可见典型的、大小均匀的六角形内皮细胞，个别细胞质膜破裂及核染色。角膜内皮细胞的活性均在80%以上。

 

3  讨论
    为临床角膜移植和实验研究提供角膜内皮活性好，保存时间长的角膜保存方法是人们研究的主要课题之一。中期保存法因其保存效果好，保存时间相对较长，设备相对简便，遂成为美国大部分眼库最常用的角膜保存方法。本试验根据我眼库现有条件配置简易中期保存液，其基本原则是保存角膜基质能维持角貘内皮细胞正常代谢。中期保存液均以细胞培养基作为基础液，为保存的角膜提供营养物质。4℃状态下，内皮细胞的代谢处于明显的低下状态，亦不产生增殖^（3），细胞只需要最基本的营养物质；目前我们尚不能生产一种满足细胞全部生理代谢所需物质的基础液。MEM是目前最常用和最基本的细胞培养基，它含有所需的必需氨基酸，谷氨酸胺，葡萄糖和主要维生素等物质，为了简化配置过程我们选用了细胞培养基MEM作为基础液。目前认为硫酸软骨素为抗氧化剂，可以防止细胞膜脂类过氧化反应，以维持细胞膜的稳定^（4）。硫酸软骨素除高渗作用外，还具有稳定细胞膜的作用。
    深低温长期保存角膜的方法是根据低温生物学原理，在适当条件下，深低温可以完全抑制细胞的能量代谢，使之处于休眠状态长期保存，当用适当的条件复温后，细胞可恢复代谢活动，发挥其生物学功能。深低温长期保存角膜技术可最长时间的延长库存角膜内皮细胞活性，可程度的满足供眼贮存的需要，并为角膜病医生提供按计划和需要进行角膜移植术的条件，是眼库长期保存角膜活性
的理想方法之一。我们应用控制降温速率理想的微机监控程序冷冻系统成功进行了供眼的角膜程序降温，在降温过程中可随意控制和改变降温速率，在降温过程中可直接观察到冷冻保护剂中的温度变化，是研究深低温保存角膜的理想设备，我们在降温过程中观察到的冷冻保护剂由液相向固相转变时释放热曲线，这是缓慢降温、减少冷冻保护剂冰晶彤成和促其玻璃化形成的标志。我们选用的冷冻保护剂是二甲基亚枫，25 g/L的硫酸软骨素加人人血清白蛋白，其中二甲基亚砜能迅速进入组织细胞，硫酸软骨索能增强角膜内皮细胞对后弹力层的黏附性并抑制冰晶的形成^（5），白蛋白对组织细胞起营养保护作用，使之在整个过程中组织细胞不受损害。降温采取缓慢降温，缓慢降温可以避免在细胞内产生冰晶，使细胞免受损害。复温则采用快速复温，这样可以减少应细胞内外的小冰晶反复聚合移动而产生的对细胞化学和机械性损伤^（6）。
    角膜内皮细胞的活性是评价中长期角膜保存效果的最重要标准。研究发现大鼠角膜内皮细胞对冷冻损伤高度敏感，在损伤修复中不能进行有丝分裂，这一点与人角膜相似，故本试验克服其取材小等不便用之作为评价中长期保存方法的优劣，并为下一步试验作为实验基础。结果显示中期保存液保存和深低温冷冻保存的大鼠角膜内皮细胞密度和内皮细胞存活率与湿房保存组在统计学上无明显差异，从而证明了我们选用的中长期方法是合理的，所保存的角膜有临床应用性。
  
参考文献
1  董晓光，谢立信，张新晨，角膜中期保存液的研制和临床应用[J]．中华眼科杂志，2000，36(1)：21～23.
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3  Georgladis NS, Ziakas NG, Boboridis  KG, et al Cryopre-served amniotic membrane transplantation for the manage-menl of symptomatic bullous keratopathy[J].Clinical＆experimental ophthalmoIoSy.2008 ,36( 2):130～135.
4  杨玉洁，高晓唯，任兵，角膜保存研究进展[J]，国际眼科杂志，2008，8(7)：1435～1437．
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